GS-FLX+ 受託シーケンス

エマルジョンPCR+パイロシーケンス


GS-FLX+の特徴

  • リード長は最大1000塩基。
  • de novoシーケンスに強みを発揮。
  • 繰り返し配列が多いゲノムの解析にも向いています。

 

GS-FLX+の原理

GS(Genome Sequencer) FLX+、GSjuniorでは、エマルジョンPCRによりDNA断片を増幅してから配列解析を行う。まず、サンプルから得て断片化したDNAの両端にアダプター(1、2とする)を結合させ、1本鎖にする。あるいは、リンカーDNAを挟んで断片の両端を連結して環状化し、その後サンプル配列の途中で切断してからアダプターを結合させる(mate-pair用ライブラリ)。そして、アダプターと相補的な短いDNAが結合したキャプチャービーズと、サンプルの1本鎖DNAとが1:1で結合するように混合し、増幅試薬とともに油中水滴エマルジョンに内包させる。これにより、オイル中にビーズひとつとDNA断片ひとつだけを持つマイクロリアクターを形成するのだ。こうして、各DNA断片は他の配列が混ざることなく、ビーズ上で数百万コピーにまで増幅される。そしてエマルジョンを破壊してビーズを濃縮し、ビーズひとつが収まる穴が無数に開いたピコタイタープレート上に載せて配列解析を行う(図)。プレート上ではアダプターに相補的なプライマーから、DNAポリメラーゼによる伸長反応が行われる。この際、伸長のための材料としてdATPのみを添加した反応、dGTPのみを添加した反応……というようにdNTPをひとつずつ入れ替えていく。伸長反応が起こればピロリン酸が遊離するので、ルシフェラーゼによる発光反応で検出できる。この技術は、リード長がGS FLX+で最大1000塩基、juniorでも400塩基と他の機種と比べて長い。そのため、ロシュの装置はde novoシーケンスに強みを持っている。

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