多用途へと進化する遠心機

遠心機の使用目的というと細胞の回収、キットやマニュアル操作によるDNAやRNAの抽出・ 精製、アッセイの際の反応液の調製、限外ろ過によるタンパク質の濃縮など多岐にわたる（表１）。硫安分画や密度勾配遠心のように高回転の遠心分離操作が必要な場合は別にして、多くの実験操作は20,000×gの遠心力が出せれば事足りることが多い。そのため、ロータの交換をするだけで他の用途にも使える遠心機があれば、実験室のスペースの確保にも役立つ。

2003年ごろから、96ウェルプレートや集菌用のボトルにも対応したロータを装着できる遠心機が国内の各メーカーで取り扱われ始めた。アングルロータとスイングロータの両方を扱うことのできる点は、用途が多岐にわたるユーザーにとってはうれしいところだ。

日立CF16RXⅡのスペック

2006 年に日立工機株式会社から販売された日立CF16RXⅡは、PCRチューブ、マイクロチューブはもちろんのこと、集菌ボトル、96ウェルプレート、96ディープウェルプレートまで対応している。さらに一度に扱うことのできるチューブやプレートの数が多いことも特徴の一つだ（図１、表2）。

研究所導入記

リバネスは2009年に戦略的基盤技術高度化支援事業に採択され、海洋微生物のスクリーニングを実施した。この中で実際に日立CF16RXⅡを導入して研究開発を行ったので、その時の話を振り返ってみたい。

50㎥ほどの研究所で、単離してきた大量のサンプルからのDNA抽出や培養した微生物の回収を、省スペースで効率的に行うことが申請時の課題であった。日立CF16RXⅡがアングルロータとスイングロータの両方に対応していたことと、研究メンバーの多くが日立工機製の遠心機を学生時代に使っていたこともあり、この機器を導入することになった。

株式会社リバネス先端科学技術研究所で微生物のスクリーニングと微生物中の機能成分の分析を行った時の実験フローを示す。 アングル、スイングの両ロータに対応しているため、1 カ所で色々な実験を行うことができた。

実際には、4ヶ月弱という期間のうちに約8,000株の微生物をとり、培養、GC-MSによる抽出物の成分分析を中心に実施した。よく行った実験のフローを図にしたので、そこを見てほしい（図2）。培養スケールの大小はあるものの、前日から培養し、チューブを使って微生物を回収してDNA抽出やGC-MS解析のサンプル調製を行っていた。15mlのチューブは一度に24サンプル、50mlのチューブは一度に8サンプルを処理することができるため、午前中にスイングロータを使ってサンプルを集めることができた。午後はアングルロータに変えてDNA抽出やGC-MS用のサンプル調製を行い、翌日以降にサンプルの解析を行うフローが出来上がった。おかげで、午後には再び培養を始められるため、微生物が確保できてデータ収集が集中した年度末の研究の効率化に一役買ってくれた。

新しい遠心機の導入を検討中で、場所をかけずに様々な用途に使えるものを探している方にはお勧めの一台といえるだろう。

最先端研究に対応できる人材育成は急務

島崎 潤一氏 （しまざき じゅんいち）

財団法人沖縄科学技術振興センター 専務理事兼所長

「あまり知られていないことかと思いますが、沖縄県は次世代DNAシーケンサーの集積地なのです。2年ほど前、沖縄県は自治体としては全国で初めて次世代DNAシーケンサーを導入しました。そして導入された3台の次世代DNAシーケンサーの管理運用は当センターが任されています。」事実、沖縄県は全国でも有数の次世代DNAシーケンサーの集積地であり、県が導入した3台以外にも沖縄科学技術研究基盤整備機構（OIST）が所有する5台の次世代DNAシーケンサーがあり、沖縄県うるま市に集中している。島崎専務は続ける。「いざ運用といっても県内では最先端の装置を扱え、次々と読み解かれるDNA配列情報を有効に県益に適う産業振興に利活用する人材が少なく、当センターでは、県内で自立的に運用、利活用できる人材の育成が急務と考え、バイオインフォマティクス人材育成推進事業に着手しました。」

研究基盤整備と同時並行で人材育成

平成14年に策定された沖縄振興計画では、日本で唯一の亜熱帯地域である沖縄の地域特有で豊富な農林水産物資源、例えば、伝統的食素材や海洋生物資源等を活用する健康バイオ産業を重点産業として位置づけている。翌平成15年には沖縄健康バイオテクノロジー研究開発センターを開所、本格的に健康バイオ産業、新産業創出に向けた研究開発が動き出した。沖縄県に次世代DNAシーケンサーが導入された経緯にはこのような背景もあるのだろう。 沖縄県は他地域に比較して教育や研究の水準が決して高いとは言えない。産業においても成熟した状況とは言い難い。現在着実に進行する研究基盤の整備を追い風として受け、今こそ科学技術及び産業振興を推進していく時期にあると言える。一朝一夕にはならない人材育成は、研究基盤等の整備が整ってからでは遅すぎる。人材育成は研究基盤整備の先を見据えて同時並行で展開しなければならない。

沖縄県の振興は地元の人材が担う

沖縄でバイオインフォマティクスを専門とする研究者、技術者は多くはいない。島崎専務は沖縄において今後必要になると判断したバイオインフォマティクス人材を継続的に輩出するための仕組みとして、沖縄独自のバイオインフォマティクス人材育成プログラムを講座として琉球大学や沖縄工業高等専門学校に導入することを目標の一つに定めて事業を立ち上げた。沖縄独自としたところには、沖縄県の振興を願う気持ちが込められていると感じた。沖縄の地域特有な農林水産物資源の生物学的情報の利活用と産業振興を、全国でも最も地元に愛着をもつ沖縄県民にこそ担ってもらいたい、島崎専務もまた沖縄が大好きなのだ。

この夏の開講を目前に、人材育成講座のカリキュラム策定が着々と進む。計画から実行までが早かったこともありスケジュールはタイトである。しかし、バイオインフォマティクス人材育成講座の趣旨に共感した県内外の多くの先生方が同人材育成講座成功のため惜しみない協力でこれを支えている。国立遺伝学研究所、理化学研究所、産業技術総合研究所、沖縄科学技術研究基盤整備機構、東京大学、琉球大学、沖縄工業高等専門学校、バイオインフォマティクス関連企業、錚々たる講師陣が沖縄のためのバイオインフォマティクス人材育成講座を展開する。島崎専務をはじめ関係者の人材育成にかける思いは同講座の成功に託され、また同講座でバイオインフォマティクスの知識・技術を習得した受講生に引き継がれ、沖縄ならではの科学技術及び産業振興が自立的に発展し続けるものと期待している。

炎症反応機構の解明を目指して

井上 浄氏氏 （いのうえ じょう）

2003年3月:東京薬科大学 薬学研究科薬剤学講座 博士前期課程 修了 2006年3月:東京薬科大学 薬学研究科 薬剤学講座 博士後期課程 修了 2006年4月:北里大学 理学部 生物科学科 生体防御学講座 助手（現助教）

井上助教らは炎症反応に重要な役割を果たすタンパク質として、Gタンパク質の1種であるRap1に注目している。Rap1を不活性化するGTPase活性化因子（GAP）の一つであるSPA-1をノックアウトしたマウス（SPA-1KOマウス）では、肝臓や皮膚に膿の塊（膿瘍）が形成される。「これは細菌などの感染に対して過剰な炎症反応が起きていると考えられます」。SPA-1KOマウスは炎症反応にブレーキが効かず、炎症が起こる際に産生されるサイトカインやケモカイン等が過剰に産生され続けている可能性を予測した。そこで、炎症反応に深く関るマクロファージに注目し、野生型とSPA-1KOマウスのマクロファージに同じ刺激を与え、両者間の遺伝子発現パターンの違いを3D-GeneⓇを使って検証した。

豊富な経験が研究者を強力にバックアップする

3D-Gene®の強みは感度の高さだけではない。もう一つの強みは、精度の高い解析データの解釈を助ける東レの研究員の存在だ。マイクロアレイなどの網羅的解析データは、解釈次第で宝の山にもゴミの山にもなりうる。その解釈を助けるのは経験だけであり、東レのマイクロアレイデータ解析経験を積んだ研究員が研究者を強力にバックアップする。

正確な解釈が研究を前に押し進める

クラスター解析及びパスウェイ解析の結果から、野生型に比べSPA-1KOマウスのマクロファージでは炎症系サイトカイン遺伝子の発現が高い傾向が得られた。更にSPA-1KOマウスの樹状細胞（DC）とマクロファージも比 較した。井上助教らはDCではSPA-1以外にもRap1のGAPとして働く分子が存在すること、マクロファージではSPA-1が主なGAPとして働いていることを発見している。つまり、理論上DCではSPA-1が機能しなくても活性化されたRap1は不活化され、マクロファージではSPA-1が機能しなければRap1が不活化されることはない。

結果はどうだったか。SPA-1KOマウスのDCでは炎症系サイトカインの多くは変化が無く、マクロファージ特異的に炎症系サイトカインの発現が強まっているという傾向が得られたのだ。「3D-Gene®の感度とデータ解釈に関する助言からSPA-1、更にRap1の炎症反応への影響に強い確信を持てた」。正確な解釈が、研究を前に押し進める。炎症反応機構の解明に向けた井上助教の研究が更に前進した。

1分子の動きを測定する手法

金城 政孝氏氏 （きんじょう まさたか）

1981年宇都宮大学大学院農学研究科修了、1985 年自治医科大学大学院医学研究科修了、医学博士、1985 年北海道大学応用電気研究所助手、1997年北海道大学電子科学研究所助教授を経て、2007年より北海道大学大学院生命科学研究院教授。

溶液中の分子はブラウン運動によってランダムな動きをしている。レーザーによる共焦点光学系を利用してフェムトリットル程度の極微小な共焦点領域を作り、そこを通過する蛍光分子の蛍光強度を観察する、ブラウン運動に起因する蛍光強度のゆらぎを観察することができる。この方法が蛍光相関分光法（Fluorescence correlation spectroscopy ; FCS）だ（原理は図1）。蛍光強度のゆらぎを相関関数によって解析することで、測定領域を通過する核酸時間からは分子の動きの速さを表す“拡散定数”が、ゆらぎの幅からは“分子数”がわかる。これらに加えて蛍光強度も直接得ることができるので、これを分子数で割ることで1分子当たりの蛍光強度も間接的に求められる。これがFCSの簡単な概要だ。一方、これを異なる2 種類の蛍光分子に対して同時に行い、蛍光強度の変化に相関がみられるかどうかを観察するのが、蛍光相互相関分光法（Fluorescence cross correlation spectroscopy ; FCCS）だ。分子どうしが相互作用している場合は、相関関数が大きくなり、相互作用が無い場合には、相関関数は小さくなる（図2）。FlucDEUX™は後者の測定装置だ。

蛍光相関分光法との出会い

「相互作用を解析することになったきっかけは、今でも解決されていませんが、アミノ酸とアンチコドンの対応関係がなぜ生まれたのかという疑問でした」と、金城氏は研究を始めた学生のころを振り返る。蛍光相関分光法で分子間相互作用が解析できると感じたのは、それから数年後になる。「ちょうどスウェーデン（Karolinska研究所）に留学していた時のことですが、DNAを使って蛍光相関分光測定を行っていた時です。測定値が予想分子量よりも1,000倍ほど大きくて原因が分からなかったんですよ。M13ファージDNAを使って研究をしていたのですが、同僚からタンパク質の場合は形が楕円だと楕円体モデルに当てはめて拡散時間が計算できることを教えてもらいました。実際M13ファージDNAでやってみると、実測値が説明できることが分かりました」。蛍光相関分光法への確信を深めた瞬間だった。

分子間相互作用解析へ

「スウェーデンから日本に戻ってきた時は、まだ日本に蛍光相関分光測定の装置が無かったので、自作しました。特に、ピンホールをあけるのが大変でした。何せ、ピンホールなんてあけたことが無かったですから」と笑いながら語る金城氏だが、測定系の構築は試行錯誤が続いた。細胞内の分子間相互作用をいかにとらえるかという問題取り組む中でも、測定系をいかに組み立てるかに腐心した。特に手法としての有効性を感じていたFCCSは、原理は単純だが、装置の特性上、構築が難しかった。そんな時、理化学研究所の宮脇敦史氏からストークシフトの大きい蛍光タンパク質Keimaの話が舞い込む。ストークシフトが大きいと、励起波長の近い他の蛍光タンパク質を一緒に使うことで、1波長で2 種の蛍光が得られるのだ。装置上の問題をプローブ側の改善によって解決したことで、2種の分子間に働く相互作用を検出する機械が誕生することとなる。それがFlucDEUX™だ。

終始穏やかな口調で話しながら、「リバネス研究費の採択者の方と近い将来共同研究するのもたいへん面白いですね」とも語ってくれた。金城氏が起こす人-人相互作用から新しい研究のブレークスルーが生まれる予感がする。

FlucDEUX™ 命名秘話
２種類の分子に異なる色の蛍光標識を施し、それぞれの揺らぎを同時に観測すれば、分子間の相互作用に関する情報が得られる。FCCS （蛍光相互相関分光法）の原理である。我々はストークスシフト（励起波長と蛍光波長の差）に着目して蛍光蛋白質の開発を行い、一波長で励起し二波長で測光するべき蛍光蛋白質ペアを完成させた。このペアを用いれば、一つのレーザーでFCCSが可能になる。この便利なFCCSシステムに名をつけるなら“一石二鳥”はどうかと考えていた。最終の命名は“FlucDEUX”となった。“Fluc”は揺らぎを表し、“DEUX”はフランス語で２を指す。ヨーロッパに向かう飛行機の中DやUなどを並べた造語をたくさん頭に放り込んで一眠り、シャルル・ドゴール空港に着いてしばらくしたら“DEUX”が醸成してきた。
（共同開発者理化学研究所宮脇敦史博士より）

[細胞シート工学] シンプルだが革新的な再生医療技術

長谷川 幸雄氏 （はせがわ ゆきお）

1986年1月 東邦大学薬学部助手 1991年11月 ファルマシアバイオテク㈱（現GEヘルスケアバイオサイエンス㈱）研究開発室主任研究員 1992年05月 同社研究開発室長 1998年04月 アマシャムファルマシアバイオテク㈱（合併により社名変更。現GEヘルスケアバイオサイエンス㈱）シニアマネージャー、グローバルR&D 東京サイトヴァイス・プレジデント 2001年05月 株式会社セルシード設立,代表取締役社長（現任） 2008年10月 CellSeed Europe SARL President ＆ CEO （現任)

「再生医療を実現したい。日本発の技術でそれを達成できるのなら喜びはひとしおだ。」インタビューの冒頭で、株式会社セルシードの社長を務める長谷川氏はそのように語った。細胞をシート状に培養し、生体に近い条件を再現する細胞シート工学の基礎は、東京女子医科大学の岡野光夫教授（同社取締役）らにより1990 年に開発された。

鍵は温度応答性ポリマーである。細胞培養用のシャーレにこのポリマーを処理する。ポリマーは細胞を培養する37℃では固体のままだが、32℃を境に液化する特性を持つため、わずか5℃の温度変化により細胞をシートのまま取り出すことができるのだ。従来の技術では細胞シートを取り出す際に酵素処理を行う必要があったため、細胞への障害が大きいことが問題となっていたが、同社の技術では細胞への障害が小さくて済むことが大きな特徴だ。この技術を用いた角膜再生上皮シートなどの再生医療用細胞シートの開発などの研究分野への応用を進めている。「非常にシンプルだけど再生医療に非常に大きな役割を果たす技術だ」。

[起業] 優れたアイデアを眠らせないために

長谷川氏が細胞シート工学に出会ったのは、同氏が外資系バイオ企業に勤めていた1995年頃。今でこそ再生医療に巨額の投資をするメガファーマも現れたが、当時は再生医療に本腰を入れる製薬企業はほとんどなかったという。「会社には何度も医薬品としての開発を提案したが、反応は薄かった。」と当時を振り返る。

この理由として、外資系企業において日本発の技術を研究開発する困難さもあるが、細胞シート工学で再生医療を実現するというアイデアには前例がないことも大きな理由であったと同氏は分析する。「誰かが始めたら後を追う動きが活性化する。日本のお家芸とも言えるそのスタンスでは日本発のアイデアは普及しない」。再生医療を実現したいという想いに人々が集い、株式会社セルシードは2001年に設立された。アイデアを眠らせてしまう構造から、一歩抜け出した瞬間だ。

[挑戦] 日本発の技術で世界中の患者を救う

セルシードには世界中の人々から毎日のように便りが届けられている。角膜に限ってみても日本国内だけで3千名の移植待機患者がおり、米国では年間4万件の角膜提供が行われている。再生医療の実現を待ち望む患者 は世界中に存在するのだ。「医薬品の開発は生命の本質に迫るので、時間も費用も莫大にかかってしまう。」歯痒 い思いが溢れる。現在開発中の角膜、心筋、食道、歯周組織、軟骨などは、移植を希望する患者が多く、かつ体性幹細胞が特定されている組織だ。理論的には体性幹細胞を採取できれば様々な組織の再生を実現出来る。しかしながら全ての体性幹細胞が特定されているわけではないため、現状では細胞シート工学を応用できない組織も存在する。折しも同じく日本発のiPS細胞に関する技術は日進月歩でメディアを賑わせている。iPS細胞の安全性や目的の細胞への分化技術が確立されれば、細胞シート工学と組み合わせることで再生医療の可能性が一気に広がる。「日本発の技術が世界中の患者に貢献する絶好の機会だ。多くの患者にこの治療法を届ける仕組みを作り上げたい。」

今年半ばにはフランスでの角膜再生上皮シートの治験が終了する予定という。セルシードという箱に集まった、アイデアを評価し、信じる人たちが再生医療という先人のいない世界を開拓し、世界にそのアイデアを提供しようとしている。2010 年3月16日、それは株式会社セルシードがジャスダックNEOに上場した日でもあり、再生医療の発展・普及を加速した、記念すべき日となるだろう。

再生医療の最先端を行く未来医療センター

CPC内部の様子

同じタイプの細胞調製室を4部屋完備し、日々再生医療の実現に向けた研究がおこなわれている。サンプルをコンピューターによって厳格に管理するなど、安全性を担保するための仕組みが何重にも施されている。

緒方洪庵が適塾を開いたのは江戸幕府の土台を揺るがした大塩平八郎の乱の翌年、1838年。日本でいち早く種痘の治療法の普及に努めた洪庵は、幕末日本における西洋医学の最先端を切り開いた。歴史に名を刻む多くの志士が学んだ適塾は、大阪大学医学部のルーツでもある。その流れは今でも大阪大学医学部に息づく。トランスレーショナルリサーチの実践の場として創設された未来医療センターは、現代医療の最先端を切り開くためのセンターといえる。

センターでは「未来医療」の開発が、2つの大きな枠で進んでいる。1つは既に実施例があるものの、一般に普及していない高度医療を実践・検証する「先端医療プロジェクト」。もう1つは大阪大学発の基礎研究を世界で初めて臨床応用することが目標の「未来医療プロジェクト」だ。両プロジェクトのもとで現在進められている13件の研究も含めて、これまで行ってきた研究の大半が再生医療に関連している。そのため、GMPに準拠した細胞培養施設（Cell Processing Center; CPC）をセンターが開設した翌年の2004年から稼働させた。CPCでは、高い水準で衛生管理されている4つの細胞調製室での培養が可能になっている。

実施成功例を積み上げる

「再生医療をいざ実施するとなると、患者さんの反応は、効果への期待と副作用への不安が五分五分という感じです。再生医療への信頼がまだ足りないのだと思います。実施成功例を増やして信用を高めていくことが重要です。」と名井先生が語るように、再生医療の普及には実施成功という形で信用を積み上げていく必要がある。今は新しい医療が立ち上がる黎明期であり、失敗は許されない。移植が原因で重篤な症状を引き起こすようであれば、臨床研究に協力してくれた患者にとって不幸であるだけでなく、再
生医療への信頼性も大きく損なわれ、医療の発展を志す医療関係者、そして何より未来の患者に対して大きな損失に繋がるのだ。そこで、センターではいち早く標準業務手順（Standard Operating Procedure；SOP）を制定し、それに則った治療が始まっている。

緊張感のある治療現場で、いま注目を集めているのがエンドトキシンである。エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁を構成するリポポリサッカライドで、敗血症やショックを引き起こす有害物質として知られている。日本薬局方では注射剤のエンドトキシンの基準値が定められているが、再生医療においては基準値が定められていない。センターではSOPで一定の基準を設けて、基準値をクリアしていない細胞に関しては再生医療に使わないという方針を採っている。手探りの状態ではあるが、この積み重ねがこれからの再生医療の標準へと繋がる。

迅速さと信頼性とコンパクトさと

2004 年の開設以来センターでのエンドトキシンの測定試験は300件以上、細胞移植は30件を超える。これまでエンドトキシンによる副作用が1件も起こっていないのは、センターのSOP基準が安全を担保してきている1つの証と言える。この安全性を支えるのが簡便で正確なエンドトキシンの測定だ。エンドトキシン測定装置として、現在評価中なのがEndosafe®-PTS™ （和光純薬工業株式会社販売）である。「エンドトキシンの測定において従来法で90 分かかったところがEndosafe®-PTS™では15分で済みます。検査の緊急性が高い再生医療分野では非常に有効な測定手段だと考えています。」と藤井さんは語る。測定限界に関しても従来法と同等で、十分な再現性も得られるため、医療現場では非常に重宝するのだという。15分で検査を完了して、細胞移植というスキームを将来的に構築できれば安全性も担保でき、患者への負担も減らせる。

「再生医療に関するセミナーに参加した際に、Endosafe®-PTS™を日常的に使用しているという施設が多くありました。限られたスペースでも簡単に測定出来る点が評価されているのだと思います」と語ってくれた藤井さんは、Endosafe®-PTS™を実験台の引き出しから取り出して見せてくれた。コンパクトさと迅速さ、もちろん正確さを兼ね備えたEndosafe®-PTS™が再生医療の現場に安全性という光をもたらしている。「再生医療はあと20年もすれば、当たり前に普及した医療になっていると思います。そこに向
けて、日本から安全性基準を含めた研究成果を打ち出していきたい。そして成果に基づいて産業を育て、ひいては再生医療も大きく育てていきたいですね」と語る名井准教授をはじめ、未来医療センターのスタッフがこれから世界に向けてどのような成果を発表していくかが楽しみである。また、安全性の評価基準がいち早く作られることが待たれる。その中でEndosafe®-PTS™が果たす役割は大きいはずだ。

名井 陽 准教授 （みょうい あきら） 医学部附属病院未来医療センター病院教授・副センター長。大阪大学医学研究科病理系専攻博士課程修了、大阪大学医学部附属病院・医員（研修医）、関西労災病院、川崎病院、大阪大学助手、同大学医学部附属病院未来医療センター准教授、副センター長を経て、現職。研究サイドから未来医療センターに関わり始め、現在も骨関連の医療を中心に活躍する。	藤井 妙恵 検査技師 （ふじい たえ） 未来医療センターで移植用細胞の検査などに従事する。現場のプロト コルを確立する中で中心的な役割 を果たしている。